N-亚硝基二甲胺（NDMA）又称二甲基亚硝胺，具有较强的肝脏毒性，属于亚硝胺类遗传毒性杂质，被世界卫生组织国际癌症研究机构认定为 2A  类致癌物，在较低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤。二甲双胍是 2 型糖尿病早期的标准药物，具有降糖作用，且低血糖风险小，价格低廉，是目前应用最广范的甲类降糖药物之一，在二甲双胍中检测出 NDMA 可能会对用药安全性产生较大威胁。

    本文参考《中国药典》2020 年版四部通则 0521 气相色谱法与 0431 质谱法，建立了使用气相色谱-三重四极杆串联质谱仪EXPEC 5231 测定盐酸二甲双胍缓释片中 N-亚硝基二甲胺的快速且高效的检测方法。

实验部分

标准品、试剂和设备

    仪 器：GC 2000 气相色谱、EXPEC 5231 三重四极杆串联质谱仪。

    标准品：N-亚硝基二甲胺（CAS 62-75-9）与氘代 N-亚硝基二甲胺 D6（CAS 17829-05-9）标准溶液购自阿尔塔科技有限公司，于-20 ℃冰箱保存。

    试  剂：盐酸与氯化钠（优级纯）；二氯甲烷与甲醇（色谱级）；实验用水

（超纯水）。

    样 品：盐酸二甲双胍缓释片购自石家庄市新华药业有限责任公司。

测试方法

化合物监测离子对、碰撞电压(CE)等参数见下图：

 图 1 化合物质谱参数

样品前处理

    使用玛瑙研钵将盐酸二甲双胍缓释片研磨为细粉，精确称取 1.1 g 粉末（约相当于盐酸二甲双胍 500 mg）于 50 mL 离心管中，加入1 μg/mL 氘代 N-亚硝基二甲胺 D6 溶液 0.2 mL，加入 1 mol/L 盐酸溶液 10 mL，涡旋振摇混合，加入 3.5 g 氯化钠与 10 mL 二氯甲烷，涡旋混合，振摇 10 min，于 4000 rpm 离心 10 min，吸取二氯甲烷层经 0.22 μm 疏水性滤膜过滤，取滤液于 1.5 mL 棕色进样瓶上机测试。

空白与加标样品谱图

为排除仪器干扰，分别在测样前、测样后、高浓度标液测试后插入空白溶剂，如图 2 所示，对应时间内无干扰峰。2.4 ng/mL 标准溶液如图 3 所示，N-亚甲基二甲胺的保留时间为 5.16 min，N-亚甲基二甲胺-D6 保留时间为 5.15 min。

 图 2 空白谱图

图 3 2.4 ng/mL 标准品测试谱图

线性和灵敏度

    使用二氯甲烷稀释 N-亚硝基二甲胺标准溶液（0.5 ng/mL、0.8 ng/mL、2.4 ng/mL、 6 ng/mL、12 ng/mL、60 ng/mL、100 ng/mL），内标添加浓度为 20 ng/mL，以定量 离子相对峰面积为纵坐标（Y），目标物标准溶液的质量浓度为横坐标（X），权重 1/X，采用内标法拟合后的标准曲线如图所示：在 0.5-100 ng/mL 线性范围内，线性系数 R2 在 0.999 以上，准确度在 94.70~108.30%，线性良好；以 0.8 ng/mL 标准溶液进样，按照 S/N=10 和 S/N=3 计算，定量限为 0.456 ng/mL，检出限为 0.137 ng/mL。

图 4 N-亚硝基二甲胺标准曲线图

图 5 0.8 ng/mL N-亚硝基二甲胺定性定量谱图

精密度

    制备 N-亚硝基二甲胺添加量为 0.8 ng/mL、2.4 ng/mL、6.0 ng/mL 的标品溶液，连续测试 6 次，计算保留时间与峰面积的相对标准偏差 RSD 值。

    0.8 ng/mL 保留时间RSD 为 0.08%，峰面积 RSD 为 4.84%；2.4 ng/mL 保留时间RSD为 0.09%，峰面积 RSD 为 6.05 %；6.0 ng/mL 保留时间 RSD 为 0.09%，峰面积 RSD为 3.86%；稳定性良好。

回收率

    对空白二甲双胍缓释片样品进行加标回收率测试，加标浓度分别为 0.8 ng/mL、2.4 ng/mL、6 ng/mL，连续进样 6 针。

    0.8 ng/mL 回收率在93.24%~108.05%之间；2.4 ng/mL 回收率在 97.65%~109.11%之间；6.0 ng/mL 回收率在 84.31%~92.28%之间；

样品测试

    按照 2.3 中样品前处理方法对盐酸二甲双胍缓释片进行处理，2 样品平行 2 次，计算浓度在 0.32-0.45 ng/mL，平均浓度为 0.39 ng/mL，即 3.55 μg/kg，检测结果小于 LOQ。

图 6 样品测试批处理

图 7 样品中目标物与内标定性定量谱图

结论

    本文建立了一种使用谱育科技三重四极杆气质联用仪 EXPEC 5231 测定盐酸二甲双胍缓释片中 N-亚硝基二甲胺的方法，考察了方法的线性、灵敏度、精密度、回收率等，结果表明：在 0.5-100 ng/mL 线性范围内，线性系数 R2 在 0.999 以上；定量限为 0.456 ng/mL，检出限为 0.137 ng/mL；稳定性测试，保留时间 RSD 小于 0.09%，峰面积 RSD 小于 6.05 %；低中高浓度加标回收率在 84.31-109.11 %；本方法可对盐酸二甲双胍缓释片中 N-亚硝基二甲胺进行灵敏、准确、快速的定量分析。

设备与耗材方案

一、EXPEC 5231 系统标准配置详情