基因毒性杂质（或遗传毒性杂质）是指化合物本身能够直接或间接损伤细胞 DNA，产生 基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向的一类物质。近年来，已经上市的药品中由于存在痕量的基因毒性杂质而引发大规模医疗事故，继而药品被召回的事件时有发生。FDA、 EMA、ICH 先后发布了对基因毒性杂质的指导原则，推荐使用毒理学关注阈值 TTC（1.5 μg/day）作为基因毒性杂质的可接受限度。我国 2020 版《中国药典》新增了《遗传毒性杂质控制指导原则》，药企在研发过程中越来越关注基因毒性杂质的控制和检测。

    亚硝胺类化合物作为一类典型的基因毒性杂质，具有强致癌性。亚硝胺类化合物由前体物质硝酸盐、亚硝酸盐和胺类化合物通过化学或生物学途径合成。这类化合物广泛存在于环境、饮用水和食品中。自缬沙坦事件发生后，亚硝胺类基因毒性杂质在全球受到广泛关注。本文针对 12 种亚硝胺类基因毒性杂质，基于自主研制的 GC-MS/MS 平台建立了 12 种亚硝胺的快速且高灵敏度的检测方法。

实验部分

标准品、试剂和设备

    标准品：12 种亚硝胺类化合物混合标准溶液购自阿尔塔科技有限公司，于-20℃冰箱保存。试剂：甲醇和乙酸乙酯均为色谱级。

    仪器：GC2000 气相色谱、EXPEC 5231 三重四极杆串联质谱仪。

测试方法

样品前处理

    准确称取 0.02 g 药品粉末置于 15 mL 离心管中，加入 2 mL 甲醇/乙酸乙酯（1:1，v/v），振摇均匀，超声萃取 10 min，离心 5 min，过滤膜，上机测试。

线性和检出限

    配制系列梯度的 12 种亚硝胺混合标样溶液（1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、200.0 μg/L、500.0 μg/L），以各目标物的定量离子色谱峰面积为纵坐标，目标物标准溶液的质量浓度（μg/L）为横坐标，建立标准曲线。N-亚硝基吡咯烷（NPYR）和 N-亚硝基二丙胺（NDPA）的线性浓度范围为 5.0~500.0 μg/L，其他 10 种亚硝胺的线性浓度范围为1.0~500.0 μg/L。在对应的线性范围内，12 种亚硝胺的线性系数 r 均在 0.997 以上，线性良好。以 5 μg/L 标准溶液进样，分别按照S/N=10 和 S/N=3 计算定量限和检出限，检出限为 0.1~0.7 μg/L，定量限为 0.2~2.4 μg/L，具体结果见表 1。12 种亚硝胺类化合物叠加色谱图如图1 所示。

图 1 5.0 μg/L 浓度水平下 12 种亚硝胺叠加色谱图

表 1 亚硝胺各组分信噪比（5.0 μg/L 浓度水平下）以及检出限和定量限

重复性

    选取 10 μg/L 和 50 μg/L 的亚硝胺混合标准溶液，连续进样 6 次，考察保留时间、峰面积的重复性。10 μg/L 的亚硝胺混合标准溶液各组分保留时间的 RSD 均小于等于 0.19%，峰面积的 RSD 均小于 5%。50 μg/L 的亚硝胺混合标准溶液各组分保留时间的 RSD 均小于等于 0.14%，峰面积的 RSD

均小于 5%。

加标回收率

    对空白药品进行加标回收率测试，加标浓度为 5 mg/kg，连续进样三针，各目标化合物计算浓度（单位为μg/L）与回收率结果如下所示，12 种亚硝胺平均回收率在 75%~110%之间。

样品测试

    按照 2.3 中样品前处理方法处理成品药盐酸雷尼替丁胶囊，其中 N-亚硝基二甲基胺

（NDMA）受基质干扰严重，其他亚硝胺均未检出，实际药品总离子流图见图 4。

图 2 实际药品总离子流图

结论

    本文建立了一种使用谱育科技三重四极杆气质联用仪EXPEC 5231 测定药品中 12 种亚硝胺的分析方法。本文考察了该方法的线性、精密度、灵敏度和准确度等，结果显示标准曲线线性良好，相关系数大于 0.997，方法精密度低于 5%，检出限低于 1 μg/L，定量限低于 3 μg/L，回收率在 75%~110%之间。3 ppb 的 LOQ 对应药物或药品 1%溶液中 0.3 ppm 的定量限，这个值满足最大剂量为 5000 mg（或更低）的药物产品所要求的的灵敏度水平，适用于大部分市售药物。因此，本方法可以对药品中 12 种亚硝胺进行快速、准确、灵敏的定量分析。

设备与耗材方案

一、EXPEC 5231 系统标准配置详情